Institute of Plant and Microbial Biology

花粉管生長是一個十分快速且具有特殊的極性生長方式，其基因之表現及調控十分嚴謹，目前雖然有許多的基因/蛋白質在不同花粉發育期中被發現，但仍有許多進一步研究的空間，例如：花粉管與花柱間之相互作用及以花粉如何利用其內物質以供花粉管快速生長等。自1999年起，我們利用鐵砲百合花粉為材料進行以下相關研究。

(A) 參與花粉管萌發及生長之基因/蛋白質選殖與分析

在研究鐵砲百合花粉發育過城中發現花粉於-20℃儲存一段時間後，其花粉管之萌發及生長速率顯著降低，且此變化隨著低溫儲存時間增加而加深，我們提出一個假說: 原先儲存於成熟花粉中的許多蛋白質與mRNAs經低溫處理過程中會逐漸降解，而這些儲存花粉欲再度萌發，需重新合成這些蛋白質與mRNAs；研究成果圖示

此外，利用此一特殊系統，可進一步對一些參與花粉管之萌發及生長之基因進行選質與分析。為檢驗此假說，首先我們利用蛋白質二維系統對新些收集及低溫儲存兩個月花粉進行總蛋白質含量比較，結果顯示於低溫儲存兩個月花粉內總蛋白質含量不論是質與量均顯著較新鮮者減少許多。進一步利用轉錄抑制劑Actinomycin D進行生長測定，結果顯示低溫儲存兩個月花粉粒之生長顯著受到抑制。這些實驗結果證實我們的假說，因此進一步利用 suppression subtractive hybridization進行一些可能參與花粉管生長之基因進行選殖。在此過程中以低溫儲存兩個月花粉內之cDNA (driver) 自新鮮花粉之ds cDNA (tester) 中將同時存在之mRNAs自新鮮花粉的mRNAs中扣除，如此得到新鮮花粉特有或含量較高的cDNA。經此篩選共得超過100 個cDNAs片段株群 (clones)，我們從其中選出22個cDNA進行Northern blot分析，結果證實大部份cDNAs在低溫儲存的花粉中隨著儲存時間增加而逐漸；然而若將低溫儲存花粉置於培養液中萌發一段時間後這些在被降解之cDNAs可再度產生。前述所得之cDNAs經RT-PCR分析發現大部分為花粉專一表現之基因，其中三個經氨基酸序列比對發現別為DnaJ，Sgt1及COP8。我們利用E. coli 表達DnaJ及COP8蛋白質及其相對應之抗體，正對其於花粉萌發生長所扮演之角色進行進一步分析。

(B) 花粉管受雌蕊誘導產生基因之選殖與功能分析

Figure 1. Microarray scanning and tree view graph analyses of the cDNAs enriched in the in vivo-grown pollen tubes.
(A) More than 5600 cDNA clones enriched in the in vivo-grown pollen tubes were obtained after suppression subtraction hybridization and the PCR products of these clones were spotted on slides for array chip preparation. The mRNAs purified from in vivo-grown 24 hr and in vivo-grown 12 or 24 hr pollen tubes labeled with Cy5-dUTP and Cy3-dUTP, respectively, were used as probes for array chips hybridization. Pseudo color obtained after microarray analyses indicated that those cDNAs were either up-regulated in the vivo pollen tubes (red spots), in the in vitro pollen tube (green spots) or expressed cDNAs (yellow spots). (B) Microarray results were analyzed by GeneSpring software for gene expression pattern presented as tree view graph.

雖然目前已有許多的基因/蛋白質在不同花粉發育時期中被發現，但相關研究結果大多來自以in vitro花粉(管)為材料之實驗，至於其是否真能反映出in vivo花粉管之情形並有類似功能則有待進一步以不同方式加以研究。鐵砲百合雌蕊具中空花柱，因此十分容易取得in vivo生長之花粉管作為研究授粉誘導產生基因之材料。以花柱內生長(in vivo) 24小時花粉管cDNA為tester，體外萌發(in vitro) 12小時花粉管cDNA為driver，以標準流程進行suppression subtractive hybridization建立一次基因庫，並從中篩選in vivo花粉管中專一或大量表現之。次基因庫建立完成後，分別從其中隨機挑出個別的單一菌株並萃取cDNA。待完成近五千個單一菌株cDNA的萃取後，以實驗設計的adapter上之專一性引子進行PCR增幅反應。將這些PCR產物純化並初步定量，再以機械手臂把這些PCR產物點在玻片上。完成微矩陣（microarray）玻片之製備後，利用不同的探針組合進行雜合實驗，以分析這些基因在不同的時間點上於in vivo及in vitro花粉管是否有不同的表現。

微矩陣玻片以不同探針組進行雜合反應並以GeneSpring軟體分析基因表現（圖1A）。從樹狀分析圖結果得知這些基因表現大致可分成幾組，第一組為in vivo花粉管中可能為專一表現或是表現量較多的基因（顯示顏色為紅色），第二組為在in vivo及in vitro花粉管中兩者基因表現量相當（顯示顏色為黃色），第三組則為in vitro花粉管中可能為專一表現或是表現量較多的基因（顯示顏色為綠色），且隨時間點的不同，表現狀況亦有所差異。依據這些分析結果，自第一組中挑選一些in vivo花粉管中可能為專一表現或是表現量較多的基因進行個別之RT-PCR實驗，以確定其表現情形。綜合分析數據及RT-PCR結果，證實了微矩陣雜合實驗的成功性，同時篩選出至少17個在in vivo花粉管中專一或大量表現的基因。進一步分析這些在in vivo花粉管中專一或大量表現的基因於百合其他器官的表現狀況，進一步萃取不同器官的total RNA以進行RT-PCR，結果可大致將其分成三群。第一群基因主要只在in vivo花粉管中表現，而在雌蕊及花粉上有較少量之轉錄產物。第二群基因則是在in vivo花粉管與雌蕊中有幾乎等量的表現。第三群基因則是在各個器官中都有表現，但以in vivo花粉管中表現量最大，而這些基因有可能與在in vivo環境下花粉管之正常生長及參與授粉作用時in vivo花粉管與雌蕊間之相互作用有關。目前正對幾組有趣之cDNAs進行全長選殖與功能分析，以判定該類基因於授粉過程中所扮演之角色。

Figure 2. Autophagosome-like compartments enclosed amyloplasts and lipid body during lily pollen germination.
In vitro-germinated 60 minutes lily pollen grains embedded in Spurr's resin, were prepared and subjected to ultrastructural investigation. A. During lily pollen germination, the tubular ER (arrows) enveloped two different kinds of organelles, the amyloplasts (a) and lipid bodies (1), to form autophagosome-like compartments. B. Higer magnification micrograph showed a typical well differentiated amyloplast found in germinating pollen surrounded by one layer of tubular ERs (marked by arrows) to form the autophagosome-like structure. C and D are two independent pictures to show that the "antenna-like" margins of starch granules progressively invade this enclosed inner membrane system. E. It was often to find that the lipid body was also surrounded by one layer of tubular ERs (arrows) to form the autophagosome-like structure which was going to completely seal the enclosed lipid body and left an open ands indicated by arrowheads. a: amyloplast, g: Golgi apparatus, l: lipid body, m: mitochondria, s: starch granule,v: vacuole, Bars=1 μm (A), 0.2 μm (B), 0.1 μm (C), 0.5 μm (D,E).

POTENTIAL AUTOPHAGIC MACHINERY INVOLVED IN POLLEN DEVELOPMENT

我們在研究花粉萌發過程中發現一個非常有趣的現象，即當鐵砲百合花粉於培養液中進行萌發時，其體內會重新形成澱粉粒體（amyloplasts）並於其中發現除許多澱粉粒外，亦含有其他胞器存在，例如：粒腺體；仔細觀察此澱粉粒體（amyloplasts）發現其外有一至數層雙層膜狀物所包覆，其形態非常類似內質網（endoplasmic reticulum, ER）。此外，澱粉粒有時亦可在液胞（vacuole, V）內發現。整個現象與酵母菌在飢餓的環境下生長時被觀察到autophagy機制十分類似。我們利用免疫金粒定位研究發現除參與澱粉合成之granule-bound starch synthase在這些澱粉粒體內發現外，COP8、COP9、RPN10、a-amylase甚至一些內質網蛋白質亦可於其內發現，以上結果意味著緣由於內質網之autophagy機制可能參與花粉管萌發時儲存物質之利用，甚至參與花粉管內液胞之形成，目前正對其可能之機制與參與之分子進行分析。