研究主題:泛素/26S蛋白酶體系統主要組成因子之功能與機制探討

1. 一、酵母菌26S蛋白酶體次單元之異源置換及過量表現影響蛋白分解
• 研究室已建立一近乎完整之各26S蛋白酶體次單元之基因剔除株系。以異源阿拉伯芥之相對應RPN次單元取代之酵母菌株系會影響其分解錯誤摺疊蛋白、生體內泛素人工受質及內生重要細胞週期調控因子(圖一)。異源取代株系對不同逆境具敏感性，其細胞週期顯現G2-M延緩缺失。過量表現內生RPN次單元亦有類似但明顯較輕微之表現型。以上酵母菌株系是26S蛋白酶體功能與結構分析之重要材料，並可藉蛋白質體學策略，進行分離26S蛋白酶體受質與調控因子(報告撰寫中)。

圖一、以阿拉伯芥26S蛋白酶體基座不同RPN次單元置換之酵母菌株顯示蛋白分解缺失與對各種逆境之敏感性。(A)對溫度、胺基酸類似物及核酸破壞藥劑逆境之敏感分析；(B)置換株系顯示具蛋白分解缺失；(C)置換株系顯示細胞週期進行之缺失。

2. 二、主要阿拉伯芥泛素受體具不同之泛素結合及蛋白酶體接收特性
• 為闡明泛素訊號之辨識機制與其功能，研究室分離與分析主要阿拉伯芥泛素受體(圖二、圖三)並將其特性與酵母菌及人類之相對應泛素受體比較。與對K63-連接之泛素鏈之親和力相比較，K6326S蛋白酶體基座次單元Rpn10及Ubl-Uba轉接因子家族Rad23及Dsk2明顯對K48-連接之泛素鏈具較大之親和力。對另外兩個Ubl-Uba轉接因子而言，Ddi1M對K63-與K48-連接之泛素鏈具相似及較弱之親和力，而Nub1僅對K63-連接之泛素鏈有微弱親和力。酵母菌與人類之相對應泛素受體其泛素結合特性與參與之泛素結合結構區具演化歧異性。對阿拉伯芥與人類而言，蛋白酶體係藉基座次單元Rpn10來接收Rad23 and Dsk2，唯對酵母菌而言，其Rad23與Dsk2很可能分別透過基座次單元Rpn1與Rpn10接收。測試之次單元包括Rpn10並不與Ddi1及Nub1結合。研究結果顯示，主要阿拉伯芥泛素受體具生化特性差異，明顯可能具功能之差異。此外，不同物種之間，其主要泛素受體應具機制與結構之明顯演化歧異性(報告撰寫中)。

圖二、阿拉伯芥主要泛素受體之泛素結合性質分析。(A) Rad23成員與Ddi1；(B) Nub1；(C) Rad23、Rpn10、S5a (人類Rpn10之同源蛋白)。 (A)與(B)為泛素受體與2-7單位混合泛素鏈之GST-pull down分析，(C)為與4單元泛素鏈之GST-pull down分析。

圖三、阿拉伯芥Ubl-Uba轉接因子Rad23成員、Dsk2及Ddi1與26S蛋白酶體基座次單元之交互作用分析。Rad23及Dsk2僅與Rpn10結合，並分別是經由UIM3與UIM1之結構區。

3. 三、一嶄新去泛素酵素OTU家族成員具不同受質專一性
• 藉由泛素單元之移除，去泛素酵素可能在具有受質專一性的情況下，調控泛素化作用。研究室發現一嶄新含OTU結構區之去泛素酵素家族。為探討成員間之可能不同功能，研究室表現、分離、與分析所有成員(除OTU8以外，證據顯示該基因應為退化之假基因)。以K48-及K-63連接之四元泛素鏈為受質，研究室分析成員之活性、動力參數與最適pH(圖四)。OTU1對K-48連接之四元泛素鏈明顯具較大活性，OTU3、4、7及10則對K-63連接之四元泛素鏈具較大活性。相對而言，OTU2及9活性較低且對兩種測試鏈型具相似活性。此外，OTU5-6及OTU11-12則對所測試之受質均無活性。一般而言，具活性成員有相當寬廣之最適pH範圍(報告撰寫中)。

圖四、阿拉伯芥去泛素化酵素OTU族成員之酵素活性分析。K48-或K63-連接之四元泛素鏈用為受質。

4. 四、藉分析T-DNA插入株系分析主要系統因子之生體內功能
• 為判斷上列主要泛素組成因子之生體內功能，研究室正建立與分析其T-DNA插入株系，包括主要泛素受體、OTU去泛素家族成員及兩個雙成員RING-型泛素黏合蛋白酶。經初步結果觀察顯示，Rad23成員之多重插入株系、Nub1與一RING-型黏合酵素基因之插入株系分別有UV光敏感性、加速根生長與早開花等性狀。

近期著作

相關資料

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