Institute of Plant and Microbial Biology

一、植物功能基因體及生物技術

青花菜黃化老化相關基因
青花菜(Brassica oleracea) 之小花採收後即快速的黃化及老化，為探討參與其老化之相關基因，本實驗室利用扣除雜交技術選殖三百多個在老化過程會增加表現量之cDNA；其中部分老化相關基因已完成選殖、表達及定性之相關研究，如： ACC oxidase、cysteine protease、metallothionein、chlorophyllase、caffeoyl CoA 3-o-methyltransferase、ethylene receptors (ETR1 and ERS)、CTR1、bifuctional nuclease以及antifungal protein；在利用基因轉殖保鮮研究方面，我們利用定點突變法將第62個胺基酸isoleucine改為phenylanine使其失去與乙烯結合的能力，並將此突變之青花菜ers (ethylene-response-sensor, boers)基因選殖到雞因轉職之二元載体中，藉由農桿菌(A. tumefaciens)導入青花菜中以研究boers對青花菜黃化的影響。從南方墨點法(Southern hybridization)我們發現大部分轉殖株為外來基因多重插入，且有基因重組現象，而其外觀則有生長延緩、植株矮化、易形成分枝、死亡率較高等的變化；轉殖株不論是葉子或小花均有延後老化之效，且其發芽種子、採收的葉片及花均表現出對乙烯不敏感，不受乙烯影響而加速老化，而大不分轉殖株均可延遲1-2天黃化。同樣變基因boers-1已轉殖到矮牽牛花中，除延長花期，延遲老化之外，轉殖株的花也增大許多。

木瓜果實成熟相關基因
我們運用相同的策略，以扣除雜交選殖426個在木瓜果實成熟過程中表現量增加的，這些假定功能基因參與木瓜成熟及熟變過程中醣類、脂肪、蛋白質、胺基酸及核酸代謝、調節基因表現及參與訊息傳遞、參與乙烯生合成、細胞壁降解及抗病及抗逆境等相關機制，59個基因與阿拉伯芥的未知功能蛋白質類似，6個與玉米的未知功能蛋白質具有相似性，另外仍有272個基因與目前資料庫中的序列無相似性；其中部分木瓜果實成熟相關基因已完成選殖、表達及定性之相關研究，如：ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) oxidases、ACC synthases、antifungal protein及tubby-like proteins；本實驗室自木瓜花的cDNA選殖到新的木瓜的ACC oxidase家族基因：CP-ACO2基因全長為1485 bp，可轉譯成318個胺基酸，預測其分子量為36 kDa，比對木瓜CP-ACO2與CP-ACO1的胺基酸序列，兩者具有77%的相同性及83%的相似性，南方點墨法分析顯示CP-ACO2與CP-ACO1在木瓜染色體中均為單一copy，且分別坐落在不同的genome位置。兩者有各自的啟動子，CP-ACO1只受切傷誘導而不受乙烯影響，而CP-ACO2基因的表現受到切傷及乙烯的正調控，此結果與CP-ACO2啟動子序列中具有三個EREs及一個WUN cis-acting element的分析結果相互吻合。從北方點墨分析法得知CP-ACO2只在果實熟變或葉片老化的晚期有mRNA的表現，而CP-ACO1則在果實成熟前即有表達；因此推論CP-ACO2是一個老化後期的相關基因，參與果實熟變與葉片老化後期快速的乙烯累積，進而誘發不可逆的老化反應促進細胞結構的瓦解與壞死，CP-ACO1除了參與果實熟變外，可能也是影響果實成熟的相關基因。而在木瓜的熟變過程中應有兩個不同的ACC oxidase調節路徑，一是調控一般的熟變過程，另一個則是調控熟變後期的相關反應。同時已將反義CP-ACO1基因轉殖到木瓜中，並可延長約3天之儲存時間。[Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 225: 697-700; J. Agric. Food Chem. 1997, 45: 526-530; Plant Physiol. 1998, 117: 717; Plant Physiol. 1998, 117: 1126; Plant Physiol. 1998, 116: 1193; Plant Physiol. 2000, 122: 1457; Plant Physiol. 2000, 122: 1457; Mol. Breeding. 2002, 9: 211; Plant Sci 2003, 164: 531-540; J. Agric. Food Chem. 2003, 51: 2569-2575; Plant Physiol. Biochem. 2004, 42:663-670].

二、阿拉伯芥TULP蛋白質—新型F-box蛋白質—之功能性基因體研究
我們從阿拉伯芥中找到11個TULP(AtTULP1-11)基因並加以選殖定性，根據其胺基酸序列分析發現其C端具有高度保守性的tubby domain，而異於動物TULP蛋白質高歧異度之N序列，取而代之的是F-box (51-57 residues) domain，根據RT-PCR分析發現所有的TULP家族基因(除了AtTULP4) 之基因表現均有其特殊性及互補性，而DNA微陣列分析則發現AtTULP2、AtTULP7、AtTULP9及 AtTULP10會參與phytohormone如：auxin、cytokinin、ethylene以及ABA之訊息傳遞，逆境與光的訊息傳遞亦會影響其基因表現；生物資訊分析指出AtTULPs 為新型之F-box蛋白質，故我們推測AtTULPs可能參與ubiquitin調節之蛋白質水解反應，也就是說AtTULPs為具有F-box之transcription factors，利用ubiquitin調節之蛋白質水解活化子(activators)及抑制子(repressors)以達到調節特定基因表現之效；我們亦證實其一TULP會藉由ABA訊息傳遞控制植物大小，此部分研究成果已進行專利聲請。[Plant Physiol. 2004, 134:1586-1597]

三、從農作物中產生高麥芽糖及高蛋白食品
我們開發一種酵素法可同時從農作物中產生高麥芽糖及高蛋白食品，此不分研究已經取得美國專利並轉研究圖示移由公司執行。另發明基因改造「甜甜米」含有轉殖水稻(台農67號)中表現耐熱性澱粉普魯南醣酶基因 (amylopullulanase，APU) 兼具 amylase及pullunanase活性，80°C高溫處理4小時後不需外加amylases即可將水稻種子的澱粉分解為糖類和高蛋白，「甜甜米」之蛋白質含量並顯著增加提升其營養價值，而其分解的醣類則可做為食品工業生產酒及醋的原料。此研發成果業已取得專利 [US Patent 6,737,563, 2004]。

四、生物催化

圖：Thioesterase I之立體結構圖。Thioesterase I具有5個β-strands (b1-b5)、7個α-helices(αA-αG)。

酵素為極有效率之生物催化劑不僅可調控生物的代謝反應亦可應用於工業上之生物轉化作用。我們主要對lipases/esterases之結構、功能及其應用性感到興趣， lipases/esterase具有廣泛之催化活性可針對不同的基質如：glycerides、esters、 thioester等進行脂肪水解、酯化及轉酯化。雖其催化三角Ser/Asp(Glu)/His具有高度保守性但其序列全長的相似性極低其結構則決定了基質的選擇及特異性。我們利用定點突變技術、NMR、X-ray結晶繞射、電腦結構模擬及DNA shuffling有系統的研究其結構與功能之關係，根據這些研究則可做出合理而嶄新的設計應用於生物催化及生物技術。

1. 我們利用脂肪酶催化反應發展新的合成法以合成carbohydrate esters、kojic acid esters、fatty acid esters及propylene glycol monoesters，此研究已獲得三項專利。[J. Am. Oil Chem. Soc. 2004, 81: 533-536]

2. 我門發現一個新型的lipases / esterases基因家族，具有不同的催化功能及新的DSLS motif，其中E. coli thioesterase I及Vibrio mimicus arylesterase之3D立體結構已經解析完成，顯示其具有較結構鬆散的活性中心因此可以具有多重功能。[J. Mol. Biol. 2003, 330:539-551; Prog. Lipid Res. 2004, 43(6):528-544]

3. Candida rugosa lipases已被大量使用在生化工業上。我們發現它包含有五個同源性很高但卻分別有不同專一性的isoform。我們可以藉由不同的培養條件來表現不同的isoform，並且也已經克服了codon usage 的問題，所以可以成功的在E. coli和Pichia pastoris表現具有活性基因重組的酵素。而lipase對不同基質具有專一性已證明是因為lipase的lid structure。此項研究專利已申請通過並授權廠商。[Lipids 2004, 39(6): 513-526]

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近期著作

相關資料

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