Institute of Plant and Microbial Biology

研究主題

載色體的生合成

植物、藻類及藍綠菌需要 phytochromes 以及 phycobiliproteins 來接受光的訊息來調控生長發育及獲得能量。這兩類蛋白質本身帶有 phytobilins 這種直鏈狀的四環結構物作為其光感應的基本分子。Phytobilins 的生合成源於原血紅素 (heme)，而在其代謝過程中有一中間產物 biliverdin IXa (BV)。在植物、藻類及藍綠藻中，ferredoxin-dependent bilin reductases(FDBRs) 催化 BV 分子上不同位置的雙鍵之還原而將其代謝為不同的 phytobilins (見圖一)。在植物中，PFB synthase (HY2) 催化 BV 分子 A 環上的雙鍵還原而合成 PFB，其為 phytochrome 載色體的先驅物質。在藻類及藍綠菌中，phytobilins 則主要是光合作用過程負責接收光能的 phycobiliprotein 的載色體，而其中 PebA 及 PebB 二個酵素分別催化 BV 分子上 15,16 碳及 A 環上二個雙鍵的還原來合成 PEB。另外，PcyA 此酵素本身催化了 BV 分子上 A 環及 D 環上二個雙鍵的還原來合成 PCB。在藍綠菌中，PCB 同時是 phycobiliproteins 及 phytochromes 的載色體。
研究成果圖示

圖一：phytobilins 的生合成途徑。在植物，藻類及藍綠藻中，phytochromes 及 phycobiliproteins 的載色體包括PFB，PCB及PEB都是經由其生合成途徑中的一個中間產物 biliverdin IXa 所代謝得來的。催化此代謝反應的酵素都屬於 FDBR 家族，包括 HY2、PcyA、PebA and PebB。

成果及未來方向
PcyA 催化 BV 分子上二個雙鍵的還原來合成 PCB，而每個雙鍵的還原需要二個電子以及二個質子。在其反應機制中，目前認為這些電子及質子是由被還原的 ferredoxin 以及酵素本身所提供，依次傳遞到與 PcyA 結合的 BV 分子上。而在其反應過程中有一個被二個電子還原 (一個雙鍵還原) 的反應中間產物，18¹,18²-DHBV (見圖一)。這表示說 D 環上的雙鍵是先被還原的，其次是 A 環上的雙鍵。我們發展出了一種在厭氧情況下的酵素活性分析方法，利用這個方法以及一些光學分析，我們偵測到在 PcyA 反應過程中，每個雙鍵的還原反應過程中存在有一個激化中間產物 (radical intermediate) (Tu et al.，2004b)。利用化學修飾法以及定位點突變，我們也在 PcyA 上找到了二個相鄰的 aspartate 及 histidine 殘基 (residue) 對於其酵素活性非常的重要 (Tu et al.，2006)。而由我們所解出的 PcyA 立體結構上，也可以觀察到這兩個殘基的確位於此酵素的反應活性中心，而且非常的靠近 BV 分子(Tu et al.，2007) (見圖二B)。由這些在 PcyA 結構及功能上的研究出發，我們想繼續問的問題包括如：其他的 FDBRs 也有類似的反應機制嗎？如果有的話，是哪些殘基決定了這些酵素的不同活性？這些 FDBR 的活性可以被置換嗎？有沒有方法去抑制特定 FDBR 的活性？


圖二：PcyA 的結晶結構
A. PcyA的完整結構： PcyA是一個單一domain 的蛋白質，由三層的 a-b-a 二級結構所形成。圖中藍色部分為 N 端，紅色部分為 C端。	B. PcyA的反應活性中心：金色的部分代表一些參與催化反應的殘基，其中包括二個相鄰的 aspartate 及 histidine (Asp102 及 His85) 殘基以及一個 glumate (Glu73)。這三個殘基都非常靠近 BV 分子 (綠色部分)，極有可能與 A 、D 環上的 carbonyl oxygen 及 vinyl carbon 形成氫鍵。紅色球狀物表示在活性中心內的水分子。

在高等植物中，phytochrome 載色體的先驅物質 PFB 是由在質體 (plastid) 中的 PFB synthase 所合成的，在阿拉伯芥中，PFB synthase 是由 HY2 基因所轉譯，如果 HY2 發生突變，植物本身受光線所調控的生長及發育，會因為喪失了有活性的 phytochrome 而被嚴重的影響。我們目前主要想要去了解 HY2 的結構以及功能上的關係，經由對其反應機制上的了解，我們可以去利用定位點突變以及定位演化法 (directed evolution) 去產生出新的酵素活性，這些帶有新活性的酵素可以被送入 hy2 突變植物株中，在植物體內去調控 phytochrome 的活性，進而去控制植物的生長及發育。另外我們也可以研發 HY2 的抑制劑，並利用此研發成果來發展新的藥物或除草製劑，來控制作物的生長及提高生產量。

│研究員簡介│研究領域│重要著作│實驗室成員│

近期著作

相關資料

Tu, S. L., Chen, H. C., and Ku, L. W. (2008). Mechanistic studies of the phytochromobilin synthase HY2 from Arabidopsis. J. Biol. Chem. In press.
Tu, S. L., Rockwell, N. C., Fisher, A. J., and Lagarias, J. C. (2007). Insight into the radical mechanism of phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase (PcyA) revealed by X-ray crystallography and biochemical measurements. Biochemistry. 46, 1484-1494.
Tu, S. L. , Sughrue, W., Britt, R. D., and Lagarias, J. C. (2006). A conserved histidine-aspartate pair is required for exo-vinyl reduction of biliverdin by a cyanobacterial phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase. J Biol. Chem. 281, 3127-3136.
Tu, S. L., and Lagarias, J. C. (2005). The phytochromes. In Handbook of Photosensory Receptors, W. R. Briggs, and J. A. Spudich, eds. (Weinheim, Germany, Wiley-VCH).
Tu, S. L., Chen, L. J., Smith, M. D., Su, Y. S., Schnell, D. J., and Li, H. M. (2004a). Import pathways of chloroplast interior proteins and the outer-membrane protein OEP14 converge at Toc75. The Plant Cell. 16, 2078-2088.
Tu, S. L., Gunn, A., Toney, M. D., Britt, R. D., and Lagarias, J. C. (2004b). Biliverdin reduction by cyanobacterial phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase (PcyA) proceeds via linear tetrapyrrole radical intermediates. J Am. Chem. Soc. 126, 8682-8693.
Chou, M. L., Fitzpatrick, L. M., Tu, S. L., Budziszewski, G., Potter-Lewis, S., Akita, M., Levin, J. Z., Keegstra, K., and Li, H. M. (2003). Tic40, a membrane-anchored co-chaperone homolog in the chloroplast protein translocon. EMBO J. 22, 2970-2980.
Sun, Y. J., Forouhar, F., H.M., L., Tu, S. L., Yeh, Y. H., Kao, S., Shr, H. L., Chou, C. C., Chen, C., and Hsiao, C. D. (2002). Crystal structure of pea Toc34, a novel GTPase of the chloroplast protein translocon. Nat. Struct. Biol. 9, 95-100.
Tu, S. L., and Li, H. M. (2000). Insertion of OEP14 into the outer envelope membrane is mediated by proteinaceous components of chloroplasts. The Plant Cell. 12, 1951-1960.